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教師簡介
本實驗室最主要是分析顯微影像,佐以生物資訊探勘技術,以及生物模擬,了解分子如何運作進行生命現象。目前研究的方向為:
1. 粒線體外型的控制機制與分泌與神經退化的關係
粒線體因為基因不穩定,以及基因組比較小,需要以不斷地分裂與融合,避免因突變所造成其功能喪失。當粒線體動態變化 (mitochondria dynamics;包括分裂與融合)有問題時,會造成細胞死亡,或自我吞噬(autophagy),造成神經退化與早衰。另外,粒線體為鈣離子恆定所需的重要鈣庫,因此粒 線體型態與分布的異常,會影響鈣離子濃度變化,進而影響胰島素胞吐與神經傳導的活性。因此了解粒線體外型的控制機制,以及粒線體外型與細 胞功能和疾病的相關性是十分重要。
目前本實驗室已經完成自動分類與定量粒線體外型(與高閬仙院長,高醫張芳榮教授,中研院許鈞南教授,中原大學蔡育秀教授合作),解出 capsase8與caspase9會抑制Bcl2,進而增加Bax轉移到粒線體,造成粒線體的斷裂。另外,其可能透過抑制Bcl- xL,使得粒線體的生成下降,造成粒線體總量下降。而粒線體的分支化抑制的分子機制,則認為與粒線體膜電位下降,活化分解OPA1有關 (Lin et al., 2010; Peng et al., 2011)。
自動化系統所擷取之形態特徵,將進一步應用於建立粒線體型態變化模擬,未來希望這個模擬系統可由靜態的影像,推導出粒線體動態變化的參 數(如 inter-mitochondrial side-to-end and end-to-end fusion rate,intra-mitochondria end-to-end fusion rate)。未來將以此系統搭配cDNA或RNAi庫篩選(與University College of Dublin的Simpson教授合作),進行高通量分析找出控制粒線體動態變化的蛋白質,再觀察其造成之粒線體的型態變化,是否影響神經細胞的胞吐與存活。
另外自動量化系統搭配資訊探勘,了解藥物篩選與藥理機制探討,以及粒線體型態變化與疾病或生理功能相關等應用。包括:
最後,我們與中研院陳培菱教授合作,將以超高解析螢光顯微鏡(PALM;resolution:5-10nm)擷取粒線體內膜皺摺 (cristae)影像,未來將分析cristae變化與生理活性的關聯性。
2. 胞吐之分子調控機制
胞吐是一項重要的生理現象,包括神經傳導物質與賀爾蒙分泌分泌,以及常備蛋白之分泌與合成。本實驗室主要研究是運用螢光蛋白標定與螢光 顯微技術(內部全反射螢光顯微鏡TIRFM、高速共軛焦螢光顯微鏡與螢光壽命顯微鏡FLIM),研究細胞內蛋白質之動態與其功能之關係。
本實驗室主要著眼於囊泡動態特質(合成biogenesis、定位docking、誘發priming、融合fusion、回收 recycle),以及如何受蛋白質(Rab3A、alpha-synuclein、rabphilin3A、SNAP-25A)及鈣離 子微域(Ca2+ microdomains)調控等,來了解胞吐的分子機制。本研究主題包括Rab3A 調控胞吐之分子機制,alpha-synuclein調控胞吐之分子機制,以極化PC12細胞搜尋調控胞吐之分子,以及自動化分析囊泡動態系統的建立。
A. Rab3A調控胞吐之分子機制
Rab3A 是一種小G蛋白,被認為控制胞吐的最後步驟。我们使用內全反射螢光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscope; TIRFM)並以EGFP-Rab3A和NPY-EGFP(neuropeptide Y-EGFP)標記PC12細胞的分泌囊泡,觀察到NPY釋放時,Rab3A會從囊泡解離到細胞質,此現象受到鈣離子,GTP水解與Rabphilin3A所控制,但對於 Rab3A如何解離與解離速度對胞吐的影響尚不清楚。
目前已經完成之項目如下:
B. alpah- synuclein調控胞吐之分子機制
α-Synuclein被認為與帕金森氏症及阿滋海默症等神經退化疾病相關,在過去的研究裡指出,α-Synuclein在囊泡的數目 對囊泡的回收以及SNARE complex形成具有調節作用。然而,α-Synuclein究竟參與在胞吐作用的分子機制,至目前還尚未釐清,特別是α-Synuclein是否經由鈣離子對調控胞吐 作用。目前本實驗室結果顯示α-Synuclein透過調節TG敏感性內質網鈣庫跟鈣離子幫浦造成細胞內鈣離子濃度的上升,來促進 SNARE complex的形成,而縮短胞吐所需要的時間。由於α-Synuclein造成的胞吐變化與GDP-bound Rab3A類似,未來將了解是否α-Synuclein透過調控Rab3A解離來造成胞吐的變化。(Lin et al., manuscript in preparation; oral presentation in Vesicle Cycle Meeting in Australia, 2007)
C. 以極化PC12細胞搜尋調控胞 吐之分子
PC12細胞株可透過NGF的作用分化成類似神經細胞的外型,分化的細胞受到刺激後,產生較高胞內鈣離子濃度的上升,分泌更多量的神經 傳導素。本計劃將比較極化的PC12細胞與非極化的PC12細胞各區域的蛋白質差異性表現以及胞吐特質變化,搜尋出調控胞吐之分子。目前 已經完成極化區域的胞吐變化與鈣離子訊號的初步研究,發現位在神經末端具有較多的基礎細胞質游離鈣離子,較高的SLMVs胞吐活性與囊泡 的分泌效能, 並且使鈣離子更有效率誘發胞吐。分化細胞透過增加囊泡總數來增加LDCVs胞吐, 而其囊泡的分泌效能並沒有改變。Mastoparan (Mas)處理釋放細胞內鈣庫的鈣離子時,分化細胞內部有較多LDCVs可直接靠近細胞膜進行胞吐。(Lin et al., manuscript in preparation)
D. 建立動態蛋白質分佈之追蹤系統
蛋白質分佈經常會隨著其功能而有所改變,如分泌囊泡蛋白,會隨囊泡在不同成熟階段(docking, priming, fusion)而變,因此本研究室嘗試建立自動囊泡追蹤系統,來進行動態蛋白質分佈之分析。目前已經建立自動囊泡追蹤系(PTrack),進行囊泡的動態分析(螢光強度、 移動速度、面積)。(Ku et al., Micros.Res. Tech. 2007)由於囊泡具有不同的動態特質,因此無法以單一追蹤法則來準確地分析,因此本小組運用多種追蹤法則(如Kalman filter, shortest distance)與自動除錯(如突然的MSD變化,運動軌跡重疊),來分析不同種囊泡動態特質(如快速移動的大的胰島素囊泡,分裂的囊泡),進一步了解不同種類囊泡的動 態特質分布。目前已經建立可以分析快速移動且外型變化劇烈的大的胰島素囊泡,其準確度已經由原本的40%提升到65%。(Ku et al., 2009)
3. 探勘未知的內質網蛋白的蛋白導向之訊號胜肽
蛋白質定位的訊號胜肽為決定蛋白質在細胞中的分布,若其分佈不正確會造成蛋白質的功能喪失,進而造成疾病。此外,後基因體世代的問題, 為了解基因的功能與其運作機制,而蛋白質分布資訊,可以提供新基因的功能之研究方向。
過去我們與中研院許鈞南教授,中原大學蔡育秀教授,EMBL的Pepperkok教授和University College of Dublin的Simpson教授合作,建立一個自動化分類次細胞蛋白質分布之螢光顯微細胞影像,為EMBL的gfp-cdna資料庫未 知蛋白進行其次細胞蛋白質分布的分類。(Lin et al., 2007; Tsai et al., 2008)
我們進一步將這個系統,將未知ER蛋白(這些蛋白沒有現今已知的定位胜肽)的細胞顯微影像進行叢集化,再由叢集的分群,將其對應的蛋白 質序列進行分析,希望找到控制ER定位或是型態的決定胜肽(與生資所李國彬教授合作)。
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